Storu dzimuma nobrieduma pakāpes noteikšana, izmantojot biopsiju

Sagatavots pēc: Frank A. Chapman and Joel P. Van Eenennaam. Sturgeons usually do not breed naturally in captivity and must be spawned artificially http://www.thefishsite.com/articles/407/sturgeon-aquaculture-specialized-techniques

Ievads

Zivju priekšnārsta uzvedība (piemēram, migrējot no jūras uz upēm), kas izraisa nobriedušu zivju pulcēšanos nārstošanas vietās, un ārējās vaislas zivju pazīmes tradicionāli ir tikušas izmantotas, novērtējot brieduma stadijas un nārsta specifisko laiku. Tomēr parasti stores nobrieduma un nārsta gatavības novērtējums bāzēts uz uzvedības un ārējo dzimumpazīmju raksturojumu. Tas var būt maldinošs, īpaši mākslīgos turēšanas apstākļos akvakultūrā, salīdzinot ar dabiskajiem apstākļiem, kuros noteikti faktori virza seksuālo briedumu un ierosina nārsta procesus.

Sieviešu kārtas storu atlasīšana nārstam bez ikru attīstības stadijas precīzas novērtēšanas bieži beidzas bez vai tikai ar daļēju ovulāciju, vai arī ovulācija notiek, bet ar zemu ikru apaugļošanās spēju un zemu kāpuru izdzīvošanu.

Daudzi faktori iespaido ovulāciju un rada nārsta panākumus mākslīgajā storu audzēšanā: temperatūra un gaismas režīms, audzēšanas metodes, manipulācijas un transportēšana, nārsta stimulēšanas procedūras un vaislas zivju ģenētiskais materiāls. Tomēr jaunākie pētījumi rāda, ka samērā vienkārša metode un laboratoriskie izmeklējumi var tikt izmantoti, lai noteiktu un prognozētu ovulācijas procesu sieviešu kārtas storēm. Vienkāršākais un uzticamākais indikators, kurš norāda, ka sieviešu kārtas zivs ir gatava nārstam, ir ikru izmērs un kodola pozīcija citoplazmā, saukta par olšūnas polarizācijas indeksu vai PI.

Ooģenēzes pamati

Īpaši saredzama īpatnība ikru (oocītu) attīstības (ooģenēzes) procesā ir to milzīgais pieaugums, pateicoties dzeltenuma un citu uzturvielu nepārtrauktajai uzkrāšanai no asinīm. Pēc dzeltenuma uzkrāšanas pabeigšanas stores ikri sasniedz savu maksimālo izmēru, kas ir labs nārsta gatavības indikators. Ikru izmērs zivīm tiek atzīts kā iedzimstoša pazīme, un ir pozitīva korelācija starp ikru izmēru un augšanas tempu; kaut arī to iespaido vaislas zivs izmērs un vecums, barības pieejamība un kvalitāte un citi apkārtējās vides faktori.

Stores parāda skaidru evolucionāru sakarību starp ikru izmēru un noteiktu sugu. Katrai no sugām ir specifisks ikru izmēra diapazons, kas parādās gan dabiskajos apstākļos, gan mākslīgajā vidē. Piemēram, zaļajai storei (Acipenser medirostris) ir ļoti lieli ikri, no 4,0 līdz 4,7 mm diametrā salīdzinājumā ar 2,0 – 2,8 mm sterletei (A. ruthenus), kam ir vieni no mazākajiem ikriem. Tipisks storu sugu ikru izmērs ir tradicionāli zvejotajai belugai (Belugas beluga), 3,6 – 4,3 mm, 3,2 – 3,8 mm Krievijas storei (A. gueldenstaedti) un 2,7 – 3,2 mm sevrjugai (A. stellatus). Ikru izmērs visbiežāk mākslīgi audzētajām storu sugām ir 3,2 – 4,0 mm baltajai storei (A. transmontanus) un 2,4 – 3,0 mm Sibīrijas storei (A. baerii).

Olnīcās atrodas folikulārās šūnas, kas veicina dzeltenuma uzkrāšanos apkārt atsevišķiem ikriem. Starp ikru membrānu un folikulārajām šūnām ir ikru horions, mainīga biezuma stingrs apvalks, kas aizsargā attīstošos embriju inkubācijas laikā. Ikriem augot lielumā, aug arī to kodoli, kas pēc tam tiek dēvēti par dīgļa vezikulām (OV). Katra dzimumcikla laikā, līdz ikri sasniedz briedumu, tajos notiek nukleārā dalīšanās (t. i., slēgtā mejoze), kamēr tie uzkrāj dzeltenumu un izaug līdz noteiktam izmēram. Šajā laikā tajos tiek pārrakstīta arī ģenētiskā informācija. Sieviešu kārtas storei, nobriestot pirmo reizi, tās ikru attīstība mejozes stadijā tiek aizturēta daudzu gadu garumā (parasti 2 – 6 gadi), kamēr zivis sasniedz dzimumbriedumu. Turpmāk katrs dzimumcikls var ilgt no dažiem mēnešiem līdz dažiem gadiem.

Nārsta panākumus primāri iespaido ikru attīstības stadija. Līdzko sugai raksturīgais ikru izmērs tiek sasniegts, ikri ieiet gala attīstības stadijā un mejozes noslēgumā. Tajā pašā laikā OV sāk migrēt tuvāk ikru apvalkam, kur notiek dīgļa vezikulas sabrukšana vai OVS. Ja ikru paraugi tiek ņemti progresējošajā laika intervālā, OV novietojums skaidri mainās no ikra centra uz perifēriju, netālu no dzīvnieciskā pola (AP). Ovālas formas ikriem ir dzīvnieciskais un augu pols (attēls Nr. 1). Dzīvnieciskā pola reģions (AP) satur vieglu, tipiski baltas krāsas dzeltenumu (F-dzeltenums), kamēr augu polam (VP) ir liels, dzeltenīgas krāsas dzeltenums (C-dzeltenums).

Kad OV ir netālu no ikru plazmas membrānas malas, zem horiona, sieviešu kārtas zivs ir nobriedusi un gatava nārstam. OV migrācija uz ikru perifēriju var ilgt no dažām dienām līdz dažām nedēļām un pat mēnešiem, tas ir atkarīgs no ūdens temperatūras. Lai panāktu lielāku svara pieaugumu, stores parasti tiek audzētas ūdenī, kura temperatūra ir par 4 – 6°C augstāka par sugai parasto. Savukārt izvēlētais vaislas storu ganāmpulks dažus mēnešus pirms nārsta jātur nedaudz zemākā temperatūrā (par 4 – 5°C) nekā nārstam optimālā. Pirms nārsta ūdens temperatūra tiek lēnām palielināta līdz optimālajai nārstošanas temperatūrai, kas atkarībā no sugas ir diapazonā starp 14 un 18°C, lai imitētu pavasarī notiekošo dabisko upes ūdens sasilšanas procesu.

Nobrieduma analīzei nepieciešamie materiāli

• Zivju manipulācijām: zivju uztveramie tīkliņi, zivju nestuves un procedūru galds, svaigs ūdens, identifikācijas sistēma vai zīmītes.
• Gonādu biopsijai: ķirurģiskie cimdi, katetrs vai lokana caurulīte vismaz 4mm diametrā, troakārs, skalpeļa rokturis un asmeņi, Adson-brown audu pincete ar 7x7 zobiem, šķēru tipa Olsen-Hegar adatas turētājs, uzsūcošie ķirurģiskie diegi ar adatām (piemēram, vikrila - poliglaktīna 910 diegi, izmērs 0 vai 1 ar vai 4 – 6 izmēra traumatisko adatu, vai arī PDS II-polidioksanona diegi, izmērs 1 ar 1 izmēra adatu), 1% joda šķīdums, sterilas salvetes, etilspirts instrumentu tīrīšanai un sterilizācijai starp procedūrām un mazs konteiners izmantotajiem asmeņiem un šūšanas adatām. 
• Ikru paraugiem: 25 ml plastmasas pudelītes ar vāciņiem, fizioloģiskais šķīdums 1 l plastikāta pudelēs, divas aukstumkastes ar vairākkārt izmantojamām aukstuma gēla pakām vai mitro ledu, lai uzturētu fizioloģiskā šķīduma temperatūru ikru pudelītēs 14 – 18°C, aksesuāri ķimikāliju svēršanai (NaCl 6,5 grami, NaHCO3 2 grami, CaCl2 300 miligrami un KCl 250 miligrami), lai pagatavotu fizioloģisko šķīdumu, sajaucot šīs vielas ar 1 l destilēta vai de-jonizēta ūdens.
• Polarizācijas indeksa (PI) noteikšanai: vienreizējās plastikāta pārnešanas pipetes (lai pārvietotu ikrus), 20 ml glāzes, alumīnija folija, marmora grants, plīts, termocimdi, taimeris, 25 ml plastmasas pudelītes ar vāciņiem, kolbu statīvs, ledus trauks, 10% formalīna fiksējošais šķīdums (9 daļas ūdens un 1 daļa formaldehīds), ķirurģiskie instrumenti, tajā skaitā smalkās Adsona-Brauna pincetes un dubultasmeņu skalpelis (vēlams tievais), griešanas virsma (piemēram, Petri trauciņa apakša), fizioloģiskais šķīdums. 
• Dažādi materiāli: pierakstu lapas vai klēpjdators (vēlams ūdensizturīgs), zīmulis/pildspalva, atkritumu konteiners, piederumu kastīte ķirurģiskajiem instrumentiem, šūšanas materiāliem u. c., konteiners ķirurģisko instrumentu dezinfekcijai, roku un/vai papīra dvieļi, mazs galdiņš, kur izvietot ķirurģiskos instrumentus, šūšanas materiālus un citus nepieciešamos priekšmetus. 

Biopsijas procedūra

Sievišķā dzimuma stores pirmoreiz tiek pārbaudītas aptuveni vienu mēnesi līdz agrākajam iespējamajam nārstam un pēc tam vēl divas vai trīs reizes, jo storu mātītes nobriest individuāli un nārsto atšķirīgos laikos. Nārsta sezona tipiski ilgst aptuveni trīs mēnešus, bet to iespējams paildzināt, ja mātītes tiek turētas zemākā ūdens temperatūrā (6 – 7°C zem nārsta temperatūras). Mātītes nepieciešams noķert pa vienai, izmantojot uztveramo tīklu, un pēc tam ievietot nestuvēs ar vēderu uz augšu. Tūlīt pēc tam zivs jāapgādā ar svaigu, skābekli bagātu ūdeni, mitrinot žaunas un aprasinot tās galvu. Tā kā pilnā biopsijas procedūra aizņem tikai 2 – 3 minūtes un lielas, nobriedušas mātītes paliek mierīgas, kamēr tiek pievadīts ūdens, nekāds anestēzijas līdzeklis netiek izmantots. Tāpat zivs nebarošana pirms šīs procedūras nav nepieciešama.

Lai paņemtu ikru paraugu, izmantojot skalpeli tiek veikts mazs iegriezums (6 – 8 mm) aptuveni pie 3. līdz 5. ventralās plātnītes pirms vēdera spuras un 2,5 – 5,0 cm no vēdera vidus līnijas. Pareizi ir iegriezumu veikt laterāli no vidus līnijas, šādi jūs nesagriežat labi apasiņotus muskuļaudus, kas var paildzināt dzīšanas procesu. Iegriezumam ir jābūt tik lielam un dziļam, lai varētu ievietot lokano caurulīti, sauktu par kanulu, vai katetru. Piemērots ciets troakārs, lai caurdurtu ādu un vēdera sienu līdz vēdera dobumam, var tikt izmantots arī kā alternatīva metode, lai tieši paņemtu ikru paraugus. Vēdera dobuma iegriezums tiek aizvērts ciet, izmantojot uzsūcošo sintētisko diegu materiālu, šujot ar pārtraukto vai krustenisko dūrienu. Ir nepieciešams atzīmēt, ka iegriezuma apgabala pārmērīga tamponēšana un dezinfekcijas šķīduma lietošana netiek rekomendēta tāpēc, ka daži ķirurģiski antiseptiskie līdzekļi var traumēt zivs ādu un stipra slaucīšana var noslaucīt gļotas, kam ir antimikrobiāla darbība. Ja nepieciešams, lieko gļotu daudzumu no iegriezuma vietas uzmanīgi noslauka ar sterilu marli un nedaudz izmanto 1% joda šķīdumu, un tas ir viss, kas nepieciešams. Zivis un ikru paraugus iezīmē.

No katras storu mātītes paraugam tiek paņemti aptuveni 20 – 30 ikri un ievietoti 25 ml plastmasas pudelītēs ar fizioloģisko šķīdumu. Pudelītes ir ērtas, jo aizvērtas tās neļauj ikriem izlīt transportēšanas laikā. Ikri tiek skaloti 2 – 3 reizes ar svaigu fizioloģisko šķīdumu, lai attīrītu tos no jebkāda olbaltuma un atbrīvotu no audiem, no traumētiem ikriem, asinīm un taukaudiem. Pēc skalošanas tiek pievienots svaigs fizioloģiskais šķīdums pietiekošā daudzumā, lai nosegtu ikrus. Ikri ir jāglabā vēsumā (14 – 18°C), ievietojot tos aukstuma kastē, kur atrodas mitrais vai gēla ledus, bet tos nedrīkst novietot tieši uz ledus. Izmantojiet kolbu turētāju vai tamlīdzīgu ierīci, lai turētu ikrus paceltus aptuveni 3 – 6 cm augstumā virs ledus, un nogādājiet tos uz laboratoriju vai novērtēšanas vietu pēc iespējas ātrāk.

Ikru polarizācijas indeksa noteikšana (PI)

Laboratorijā katrs ikru paraugs tiek ievietots atsevišķā 20 ml stikla trauciņā un atzīmēts ar stores identifikācijas numuru. Katrā trauciņā tiek pievienots fizioloģiskais šķīdums līdz 15 – 20 ml atzīmei, un ikrus uzmanīgi vāra aptuveni piecas minūtes. Katrā trauciņā ieliek nedaudz marmora grants, un visus trauciņus nosedz ar alumīnija foliju, līdz vārīšanas laikā traukā ikri dažbrīd "palecas".

Pēc vārīšanas ikri tiek atvēsināti 15 – 30 minūtes, novietojot trauciņus tieši uz sadrumstalota ledus. Pēc tam ikrus ir iespējams pārgriezt un veikt mērījumus. Dažām ļoti nobriedušām storēm ikri ir nedaudz mīksti pat pēc vārīšanas. Tādus ikrus nepieciešams fiksēt 10% formalīna bufera šķīdumā aptuveni 24 stundas. Tad šie ikri top stingrāki un vieglāk pārgriežami.

Ikri tiek griezti pa to gareno (vegetālo) asi, parasti to ir viegli noteikt svaigi ņemtiem ikriem pēc to ovālās formas. Tomēr ikru vārīšanas, atdzesēšanas un fiksēšanas rezultātā tie paliek izteikti apaļi. Par laimi, vairumā gadījumu ikra dzīvnieciskais pols (AP) ir ar izteiktu krāsu (balts aplis un/vai dažāda lieluma punkts).

Katrs ikrs individuāli tiek turēts ar pinceti un pārgriezts ar skalpeļa asmeni. Ja griezums ir precīzs, tad, pagriežot abas puses ar griezto virsmu uz augšu, tām jābūt kā spoguļattēlam (attēls Nr. 1). OV klātbūtne tiek novērota, fokusējot vieglu gaismas staru (piemēram, ar anatomisko mikroskopu ar optisko šķiedru reflektoru) uz jebkuras no pusēm. Svarīgs faktors PI noteikšanā ir ikru precīza pārgriešana pa to garenisko asi. Ikriem jābūt pārgrieztiem tā, lai rastos divas vienādas puses ar vienāda izmēra OV abās pusēs. Ja jūs nogriežat slīpi un/vai netrāpāt gareniskajai polu asij, PI mērījums nebūs precīzs. 

Lai aprēķinātu PI, pirmais mērījums ir garākais diametrs pa garenisko asi. Nākamais ir jāizmēra attālums no OV ārējās malas līdz ikru membrānai vai ikru horiona apakšas (tievā melnā pigmenta kārta). PI tiek aprēķināts, dalot kodola attālumu līdz ikru perifērijai ar ikru diametru. Nārsta procedūrām izvēlieties mātītes ar PI mazāku par 0,10, bet vislabākās zivis ir ar ikru polarizācijas indeksu no 0,06 līdz 0,08.

Lai veiktu ikru mērījumus, var izmantot dažāda veida aparatūru: no vienkārša anatomiskā mikroskopa ar okulāro mikrometru līdz digitālajam stereoskopam ar datorizētu attēlu sistēmu. Ir ieteicams anatomiskais mikroskops ar maināmu palielinājumu (piemēram, 5x, 10x, 20x, 40x), ko iespējams iestatīt tā, lai atsevišķi ikri ietilptu vienā redzes laukā pie lielākā iespējamā palielinājuma. Dažreiz storu ikri ir pārāk mazi precīziem mērījumiem pie maza palielinājuma un pārāk lieli - pie liela palielinājuma. 

Trinokulāros anatomiskos mikroskopus ar pievienotu videokameru un TV/video ekrānu var izmantot, aplūkojot pārgrieztos ikrus, un pēc tam ar lineālu uz ekrāna var izmērīt attālumus, lai aprēķinātu PI. Līdzīgi var izmantot digitālo kameru vai datorizētus mikroskopus, kas savienoti ar klēpjdatoru, un ikru mērījumus veikt tieši uz monitora attēla vai izmantojot attēlu mērījumu programmatūru (piemēram, cell profiler: <http://genomebiology.com/2006/7/10/R100>). Lai arī kāds aprīkojums tiktu izmantots, jāiegūst tāda pieredze un iemaņas, lai pēc kāda laika varētu novērtēt PI bez ikru parametru instrumentālas mērīšanas.

Redzams polarizētais kodols jeb OV, dzīvnieciskā (AP) un augu (VP) poli. OV atrodas dzīvnieciskā pola reģionā, kortikālajā citoplazmā. Abu polu pozīcijā palīdz orientēties noslāņojušās un novirzījušās dzeltenuma granulas. 
Ikru polarizācijas indeksu (PI) aprēķina šādi:  
PI = B/A; kur
A ir ikra diametrs, neskaitot membrānu (horionu), un
B ir attālums no OV virsotnes līdz ikra membrānai.

 Nārstam izvēlas stores mātītes ar ikru polarizācijas indeksu (PI) mazāku par 0,10.