Ikgadējā EURL ECVAM PARERE NETWORK dalībnieku sanāksme

Apaļā galda diskusija par PARERE Tīkla (3Rs, alternatīvas pētniecībā) izveidošanu dalībvalstīs

Dalībvalstu (DV) diskusijā noskaidrojas, ka vairumā DV nav izveidots oficiāls PARERE Tīkls. Kontaktpunkti atzīst, ka tas ir apjomīgs, dažādu nozaru ekspertu kopdarbs, liela problēma – trūkst kvalificētu, šaurās jomās specializējušos toksikologu (piem. ekotoksikologu). Daudznozaru sektoru Tīkls darbojas samērā kūtri, jo zinātniekiem nav īpašas vēlmes iedziļināties, komentēt un piedalīties. Tomēr vairumā no DV, kurās formāls Tīkls nav izveidots, zinātnieki savstarpēji komunicē, organizē sanāksmes, apspriedes par alternatīvajām metodēm/pieejām u.c. Kopumā aktīvāka komunikācija notiek tieši par EURL ECVAM stratēģiskiem dokumentiem, kur nav nepieciešama šauras jomas specializācija kādā atsevišķā zinātnes nozarē.

DV, kurām ir reģistrēti atsevišķi Tīkli vēlas tos saslēgt lielākā valsts platformā. Tīklā ir apvienoti dažādi eksperti, piem., toksikologi, ķīmiķi u.c., kas strādā ar “in vitro”, “in silico”. Austrijā ir izveidots labs, funkcionāls Tīkls, aicina visas DV iepazīties!!!!

DG Environment pārstāve S. Louhimies – pasākās DV kontaktpunktiem un uzsver mūsu lomu, direktīvas 2010/63/EU “on the protection of animals used for scientific purposes” prasību ieviešanā un arī izpildē.

NORDIC pārstāvis – pašreiz alternatīvas un ar tām saistītās aktivitātes vairāk skar “chemical safety”, mazāk farmāciju un pārtikas drošību. Skandināvijas valstīs izveidoti 3Rs centri, kur strādā tieši ar šīm iniciatīvām. Ieteikums, kā aktivizēt informācijas apriti un Tīkla darbību: Jātiekas sanāksmēs, darba grupās DV pārstāvjiem – likumdevējiem, Nacionālajiem kontaktpunktiem., u.c., sarakste - e-pasti par aktuālām tēmām (Highlight articles, piem., no PARERE), protams iespējami arī dažādi vienkāršoti Tīklošanas veidi. Tāpat DV par PARERE aktivitātēm jākomunicē ar žurnālistiem, sabiedrība maz zina par šiem jautājumiem.

Par RARERE konsultācijām – Diskusijas koncentrējās galvenokārt uz divām, nesen uzsāktām EURL ECVAM konsultācijām par jaunizstrādātām “in vitro” metodēm, kas paredzētas: iespējamo neiro-toksikantu atklāšanai un mērīšanai; iespējamo toksisko vielu izdalīšanu no cietiem materiāliem, piemēram, metālu sakausējumiem.

1) Consultation of PARERE on the EDITOX test method submission (F.Pistollato, EURL ECVAM)

Metode izstrādāta Francijā, tipiska “in vitro” šūnu metode, kurā izmantoti cilvēka neiroblasti, metode pamatojas uz kvantitatīvu RNS analīzi serotonīna receptoru modifikācijā “A to I RNA changes”. Metode bāzējas uz SH-SYSY šūnām ko ekspresē attiecīgi receptori, atkarībā no tā tiek izdalīta zema, vidēja vai augsta riska iedarbība. Tajā 3Rs: īslaicīgi samazina (in vitro based EDITOX) grauzēju izmantošanu analoģiskos testos, Ilgtermiņā aizstāj vispār. Tests izstrādāts un validēts ķīmiskajiem savienojumiem, ne bioloģiskajiem.

EURL ECVAM – jautājuma būtība, vai šī metode var tikt virzīta tālākai izstrādei.

  • Vai EDITOX ģenerētā informācija ir būtiska regulatorā kontekstā?
  • Vai šī metode ir nozīmīga dažādiem sektoriem (piem. biocides, pesticides, pharmaceuticals)

2) Consultation of PARERE on the bioaccessability method (P.Prieto-Peraita, EURL ECVAM)

Metal copmounds and their applicability in the framework of CLP Classification, Labelling and Packaging (CLP) (1272/2008).
Sākumā izskatīta atbilstība dažādām likumdošanas prasībām LEGAL INTERPRETATION ARTICLE 12 B CLP-CA/56/2016 un piedāvāta klasifikācija, piem. pēc CMR.

Vai DV pārstāvji piekrīt šai klasifikācijai? Diskusija par Bioelution – bioaccessability method of metal, kas būtībā nav toksicitātes tests, bet metodi izmantos salīdzināšanai (target and reference material). DV pārstāvji iebilst, ka šī metode nav saistāma ar 3Rs un dzīvnieku izmantošanas alternatīvu. Bet uz to jāsniedz atbilde regulatoram (likumdevējam).

Tomēr Kobalts – neorganiska substance. Vai tas var tikt izmantots konkrētā formā – savienojumā, kā uz to reaģē kuņģa zarnu šūnu membrāna - absorbē/neabsorbē? u.c. ADME parametri. Kā vērtēt šī metāla ietekmi, drošību, un, kā to no in vitri, in vivo (peles) pārnesīs uz cilvēka organismu, kur ir pilnīgi citi fermenti, skābes koncentrācija u.c. Metodes izstrādājam jāsagatavo atbildes.

PARERE lūdz komentēt jaunās, validācijai iesniegtās alternatīvās metodes. Konsultācijas (ieteikumus, viedokļus) lūdz iesūtīt 20. janvārim.

3) Priekšlikums Vadlīnijiām “on the characterisation of “in vitro” human hepatic metabolic clearance methods” (A. Lostia , EURL ECVAM)

Toksikokinētikas dati (informācija) aizvien vairāk nepieciešami vielu un substanču toksicitātes izvērtēšanā. Nopietnus sarežģījumus rada starpsugu atšķirības, kā arī daudzveidība sugas ietvaros (human variability). In vitro salīdzinošais metabolisms PPRP Reg.1107/2009, diemžēl šobrīd nav vadlīnijas metodes izmantošanai un datu interpretācijai. Arī EFSA nav. Aktuāls jautājums, kuras in vitro hepatic clearance metodes ir būtiskas un nepieciešamas pēc iespējas vairāk nozarēm. Tādēļ šādai metodei ir jātop izstrādātai, kā arī jādefinē, kādiem datiem jātiek izmantotiem metodes ietvaros. Jāizšķiras par stratēģiju – vai ņemam vienu metodi par pamatu (standartizē), vai izmanto vairākas zinātniski pamatotas metodes. Tādēļ nepieciešams OECD dokuments - Vadlīnijas. Perspektīvā tas nozīmē jaunas metodes izstrāde, tās apstiprināšana ar likumdošanas aktu, kas definē testa izmantošanai atslēgas aspektus.

4) New project proposal to the OECD to develop a Performance-based Test Guideline on Defined Approaches for skin sensitisation testing (S.Casati, EURL ECVAM).

Par integrēto pieeju testēšanai un novērtēšanai (Integreiting approaches to testing and assessment IATA)

Pētījumi jāsāk ar esošās informācijas apkopošanu, analīzi; Read a cross un datu, hipotēzes nozīmīguma izvērtēšanu. Jauni OECD dokumenti (mājas lapā) ENV/JM/MONO (2016) 29-ANNEX 1.

Šeit pieejamas ne tikai vadlīnijas, bet arī pašas metodes, kuras var lietot. Diskusijas par to, kas notiek ar metodi un vadlīnijām, ja tiek izmainīts regulējums?

Nākotnes izaicinājums – dažādu testa metožu kombinācija, piem, “in vitro” un “in silico” – Integrētās metodes. Kā arī ar šīm metodēm iegūto rezultātu salīdzināšana.

OECD vadlīnijas (guidance document on defined approaches)
OECD IATA vadlīnijas

EURL ECVAM Network & ESTAF forums

EURL ECVAM sniedz pārskatu, kas 2016 gadā padarīts Alternatīvo metožu/pieeju jomā

Pašreiz uzsākta: “in vitro” metožu izmantošana vakcīnu partiju pārbaudē. Piemēram, trakumsērgas vakcīnai un citām veterinārijā izmantojamām vakcīnām antigēnu efektivitāti pārbauda ar “in vitro”, dzīvnieku izmantošana vairs nav nepieciešama.

Par iesniegto dokumentu izvērtēšanu

3 dokumentu pirms iesniegšanas izvērtēšana:

  • Ashland RHE SIT (skin irritation, similar test);
  • EDITOX (risk of chemical to inducepsychiatric adverse side effects depression and/or suicide);
  • Bioelution (provides the fraction of a substance that dissolves under surrogate physiological conditions and is potentially available for absorbtion into systemic circulation; bioaccessibility testing)

3 pilnas versijas dokumentu iesniegšana:

  • skinEthic serious HCE EIT (serious eye damage, eye irritation;
  • Steerlab RHE SIT (skin irritation, similar test), 
  • SENS-IS (Skin sensitisation)

Informācija par validētām un akceptētām alternatīvām metodēm

Direktīvas 2010/63/EU pārskatīšana - S.Louhimies, DG.Environment par alternatīvo pieeju izstrādi un izmantošanu fundamentālajā, lietišķajā un aprakstošajā pētniecībā, kā arī izglītībā un apmācībā, kā to nosaka Direktīvas Art.58 – jāpārskata direktīva, kā DV ieviesušas direktīvu 2010/63/EU, kā iesniedz pārskatus? u.c.

Mērķis šai pārskatīšanai - noskaidrot direktīvas “vājās vietas”, kas nav ieviests, kas nav saprasts u.c. Par DG Environment veikto DV aptauju: saņemtas gandrīz 1000 atbildes (no tām audzētāji, lietotāji ~ 830). Visas atbildes vēl nav izskatītas, un nav izanalizētas. 

Kas mainījies kopš 2009.gada (iepriekšējie iesniegtie pārskati).
Primātus diemžēl joprojām izmanto pētniecībā. 3Rs efektīvi ieviests izglītībā, arī fundamentālajos un lietišķajos pētījumos. Ļoti palīdz EURL ECVAM speciālisti un DV 3Rs centri.

  • Perspektīvo “in vitro” metožu identificēšana – J.Barrosa, EURL ECVAM

2 soļu iesniegšana: TPF Pirmais vērtējums: Pre submission; TST Pilnais vērtējums; complete submission. Uzsver, ka arvien grūtāk panākt metodes atbilstību detalizētajam normatīvajam regulējumam. Grūti identificēt progresīvās metodes tieši agrīnā izstrādes/standartizācijas stadijā. EURL ECVAM šai aktivitātei meklē akadēmisku spēku palīdzību!

  • Slimību modeļi biomedicīnas pētījumos - L.Gribaldo, EURL ECVAM

Dzīvniekus joprojām daudz izmanto biomedicīnas pētījumiem. Pieaudzis transģenētisko dzīvnieku skaits, ģenētiski modificēto dzīvnieku skaits.
Visvairāk izmēģinājumos izmanto grauzējus; suņus - bīglus visbiežāk kardiovaskulāro slimību, kā arī plaušu un novecošanās slimību pētījumiem. No “in vitro” metodēm vēža attīstību un šūnu reģenerācijas spējas labi palīdz izprast cilmes šūnu modeļi.
Identificētās perspektīvas:
3D modelis zāļu izstrādei (3D models for drug development), 
Infekcijas slimību in silico modelēšana (in silico modeling for infection disease), 
Orgānu modelēšana mikroshēmās (organ on a chip modeling).

  • Highlights on alternatives ESTIV (EUROPEAN SOCIETY OF TOXICOLOGY IN VITRO) ww.estiv.org sekmē, veicina in vitro un in silico toksikoloģijā.

ESTIV organizē kursus, 2015.g. bija Lisabonā., 8-13.janvāris 2017.g. Luxemburgā. Piedāvā arī “in vitro” praktiskās apmācības kursus. ESTIV apvienojušies daudzu valstu zinātnieki, Latvijas zinātnieki pagaidām nav, aicina pievienoties! 2018.gadā plānots starptautisks kongress Berlīnē.

  • Highlights for alternatives EUROTOX (ES Toksikologu apvienība) www.eurotox.com

Bezpeļņas organizācija, darbības joma “in vitro” attīstība zinātnē – farmakoloģijā, toksikoloģijā. Rīko arī darba grupas, mācības, kā arī piedalās likumdevēju konsultēšanā.

  • Highlights for alternatives ECOPA (E Consensus Platform for Alternatives) www.ecopa.eu

Bezpeļņas organizācija. Sastāvā nav tikai zinātnieki, bet arī akadēmijas pārstāvji, stakeholder (piem. industrija), dzīvnieku aizsargi. Pēta un izpēla informāciju par 3Rs un dažādām alternatīvām pētniecībā. Privātpersonas arī var būt var būt locekļi. Aicina pievienoties! 
Rīko sanāksmes, mītiņus, sadarbojas ar citām organizācijām. 2017. gada 14.-16. jūnijā Helsinkos būs seminārs par “Risk assessment in disease models un 3Rs slimību modelēšanā” ar uzsvaru uz Read a cross metodes integrēšanu pētījumos.

  • Highlights for alternatives CAAT (Center for Alternatives to Animal Testing)

Atbalsta un veicina pētījumus par “in vitro” un citu alternatīvo tehniku izstrādi. Uztur diskusiju forumu, networku, organizē mācību sesijas u.c., piem., www.caat-academy.org. Piedāvā reālas testu stratēģijas www.reachmastery.com.

  • Highlights for alternatives AFABILITY (Animal Friendly Antibody Production).

Jauna organizācija, veic izpēti un apkopotu datus par in vitro iespējām antivielu ražošanā. Joprojām imunizē dzīvniekus, kaut gan ir plašas alternatīvo metožu un pieeju iespējas. ES likumdošanā, šis dzīvnieku izmantošanas veids ir kategorijā “Izmantošana normatīvā regulējuma ietvaros”, klasifikācija: var piemērot neatgriezeniska/viegla (atkarīgs no interpretācijas), tātad par šādās procedūrās izmantotajiem dzīvniekiem pārskatos nav jāziņo, tomēr reāli visvairāk dzīvniekus izmanto tieši antivielu ražošanai (bet tie netiek uzrādīti). In vitro iespējas ir plašas: Rekombinantās antivielas ( scFv u.c. fragmenti/ir variācijas); Fāgi (Production naive phage); Mimētiķi, palīgmolekulas (aptemers, affimers, DARPins, affibodies) etc.

Izstrādātie in vitro projekti jau ir pat 20 gadus veci, tomēr lielākā daļa vēl nav adoptēti. Tos ražotāji neizmanto, jo alternatīvu apgūšana ir laika un finanšu ietilpīga. Šīs kategorijas procedūrām Direktīvā nav iestrādāts “piespiedu” izpildes mehānisms. Steidzami nepieciešams EURL ECVAM un DG Environment stratēģijas formulējums, Nothingem University tiek veidota (izstrādāta) fāgu displeja datubāze. Pašreiz arī notiek diskusiju forums par minētajām tēmām: www.afability.com 

Likumdošanā noteikto alternatīvo pieeju izmantošana toksikoloģijā ķīmisko vielu/substanču testēšanā un drošības pārbaudē

Defined approaches for skin sensitisations

Ir definētas pieejas/metodes ādas sensitizācijai. Pieejas balstītas uz “read a cross”, pierādījumu/iepriekšējo pētījumu izvērtēšanu “in vivo”, “in vitro”, “in silico”. t.i. kā ķīmiskās vielas ietekmē molekulas, šūnas>>orgānus>>organismu + atbildes reakcijas. Šādā veidā notiek izvērtēšana, kā da ir vielas gala iedarbība uz ādu. OECD Vadlīnijas attiecībā uz ziņojumiem par definētajām pieejām toksikoloģijā.

Galvenās sadaļas: Par ziņošanas veidnēm (paraugiem) pieejām; Kopsavilkums – rezumējošs pārskats par Definētām pieejām; Galvenā informācija – piešķirtais identifikators, izstrādes datums, autori, atjauninājumi, atsauces, īpašumtiesību aspekti, Mērķparametri: piem., ādas kairinājums; Mērķis/ regulatorā nozīme - piem. Skreenings, bīstamības novērtējums, prognozējamās potences. Tās pamatojas uz aprakstošajām “in silico” metodēm/pieejām! Piem., QASRs pieeja: peptīdu saistīšanas reakcijas >>> “Keratino sens” vai “gene signature” >>> h-Clat: >>> vērtē ir/nav sensibilizācija. Ir dažādi veidi (dažādi kritēriji) definēto pieeju izstrādei/izmantošanai. Biopieejamība (Bioavailability) ir vissvarīgākais faktors ādas jūtības testēšanā, tomēr tas nav definēts kā atslēgas (key) faktors. Jo tam nav sistēmisks efekts, t.i. ir aktuāli ādā, bet ne asinsritē.

DG. Environment (Regulators) S.Louhimies uzsver, ka šī jautājuma risināšanai nepieciešama pasaules mēroga pieeja, jo tuvojas likumdošanā noteiktais laiks, t.i. 2018.gads, kad vielu/substanču drošības pārbaudēs drīkstēs izmantot tikai in vitro in silico metodes un pieejas, tomēr joprojām vāl nav nepieciešamās ekspertīzes, lai minētais nosacījums realizētos.

Diskusiju Panelis, eksperti: visumā pozitīvi vērtē konceptu par ādas kairinājuma in vitro testu definēto pieeju, tomēr ir vēlme, lai šīs pieejas un metodes tiktu standartizētas. Par vielām, ko izmanto kosmētikas ražošanai, ļoti aktuāli ir abi – gan false positive, gan arī false negative rezultāti. Diemžēl šī definētā pieeja (frameworks) neģenerē false negative opciju. Savukārt tas rada bažas par iegūto rezultātu objektivitāti.

Ir ļoti liels vairums ķimikāliju, kuras vēl jātestē un jāklasificē, saprotams, ka līdz 2018.gadam to nespēs izdarīt, un uz “in vitro” pilnībā pāriet nevarēs. Iespējams būs nepieciešamas izmaiņas likumdošanā vai pārejas periods. Darba gaitā (pārejai uz vitro toksikoloģijā/vielu testēšanā) vājie punkti (momenti) pedantiski jādokumentē.
Ir variants lietot individuālus testus un ģenerēt “a cross of evidence”, tas atvieglos gan regulatoru, gan pētnieku darbu. Bet kā šajā pieejā integrēt “human variability”? Vai izmantojot Diferencētās pieejas tiek gaidīti dažādi rezultāti par dažādām pieejām, jautājums regulatoram kā tie tiks vērtēti/prioritizēti?

EFSA uzskata, ka Defined approaches for skin sensitisations ir laba pieeja

Fleksibla, brīvība interpretēt, tomēr regulatoriem nepatīk šīs metodes elastīgums, uzskata, ka nepieciešamas vienotas Testa vadlīnijas. Tāpēc arī šai metodei, ja tā tiks atzīta par labu esam, būs nepieciešams regulatīvs akcepts un vadlīnijas. Tāpat jāņem vērā, ka tīras substances praktiski nekad nenāksies testēt, vienmēr būs substanču maisījumi, kas jāņem vērā apsverot iepriekšminētās pieejas izmantošanas iespēju. Nepieciešamas arī vadlīnijas, kā jāapmāca toksikologi darbam ar jaunajām pieejām/metodēm, daudzās valstīs toksikologu kapacitāte ļoti vāja.

Read - across case studies (Seurat – 1) Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing) http://toxbank.net/about/seurat-1

Uzsver, ka vielu lietderīguma pārbaudes jāsāk ar ķīmiskās struktūras similaritātes izvērtējumu jau zināmās līdzīgās vielās. Nozīmīgi: transparence (caurskatāmība) atkārtojamība, dokumentēšana. Šabloni ar paraugiem pieejami kā world files. ECHA veido vadlīnijas par read a cross submissions and justifications, kurā tiks ietverti arī read across argumenti.

Read a cross: potenciāli spēj prognozēt “komplekso” toksicitāti, sniedz datu kvalitatīvu un kvantitatīvu izvērtējumu, vērtē similaritāti, pamatojoties uz vielu/savienojumu ķīmiskajām toksikokinētiskajām un toksikodinamiskajām īpašībām, in vitro analīzes un in silico dati, ieskaitot jaunās metodes stiprina toksikodinamikas similaritātes pamatojumu. Toksikokinētikas mainīgums (piem. ADME, īpaši metabolisms) bieži ir limitējošs faktors. QASRs (Quality Assurance System for Recognition Scheme) šajā gadījumā nelieto, jo tam nav regulatoru akcepta. Vajag vairāk konkrētuma, skaidrības lietotājam par Read a cross. (EFSA). Read a croos, (kā ad hoc) ir subjektīvāka par citām metodēm, tāpēc tai arī vajag vadlīnijas, stratēģiju metodes izmantošanai. Vēl jāņem vērā, ka ar šo metodi ir problemātiski vērtēt substances ļoti mazā/augstā koncentrācijā (in vitro).

SEURAT – 1 http://www.seurat-1.eu/  jaunākā informācija par Antivielu (Ab) initio case studijām un nākotnes perespektīvām.

Ekspertu panelis: Ir daudz 3Rs izaicinājumu. Meklēt/identificēt target (mērķa) molekulas, ietvert apsvērumus par vielu/substanču metabolismu. Būtiski - koncentrācijas, kādas vispār sasniedz mērķa molekulas! Kādi iespējamie riski, to analīzes. Jautājumu ir vairāk kā atbilžu. SEURAT 1 framework var atrast informāciju par iespējamiem riskiem: kādus izmanto risku vērtēšanai? Būtiski: kā izmantot IT rīkus. Mācības par jauno tehnoloģiju iespējām. Tā ir robusta informācija, ko var izmantot jebkurš, jāzina katrai metodei kā. Vadlīnijas atkal nepieciešamas pareizai un vienveidīgai piemērošanai. Šādai kompleksai pieejai vēl nav regulatoru akcepta.
Cik daudz vēl case study un vadlīnijas vajag, lai uzticētos rezultātiem un saņemtu regulatoru akceptu? 

Zinātnieku jautājums: ko darīt turpināt izstrādāt atsevišķās vadlīnijas un pētīt esošo likumdošanu, vai sakām pietiek, jo nepieciešams citāds normatīvais regulējums, jo esošais no zinātnes viedokļa nav efektīvs un izpildāms.

Vēl aktuāli jautājumi: Tieši, kas ir jāmeklē toksikoloģijā? Specifiskie atslēgas elementi riska izvērtēšanas kontekstā? Kas vēl trūkst, toksikoloģijā bieži nevar paredzēt, kas vēl var notikt. Kā mērīt efektu? Trūkst kinētikas. Ilgstošai un īslaicīgai ķīmisko vielu iedarbībai. Jāņem vērā, ka ķīmiskās vielas organismā uzkrājas. Kā integrēt toksikokinētiku riska izvērtēšanā? Arī dzīvnieku modelī kinētikas efektu pilnvērtīgi nevar izvērtēt.

Jāizstrādā in vitro kinētika, lai vāktu informāciju par ADME rādītājiem katrai vielai!

Grūtāk ir no in vivo uz cilvēkiem ekstrapolēt, kā no „in vitro” uz „in vivo”! Cilvēku audus (veselus) daudz izmanto ex vivo. Vajag protokolus, lai tos pareizi nolasītu, apkopotu un arī veiktu pašus testus. Pastāv arī problēmas ar individuālo varietāti. Kā pareizi lietot perspektīvo PPBPK (exposure assessment) modeli? Vieglāk iegādājami human tissuses! Farmāciju u.c. nozares arī jāintegrē toksikokinētikas/dinamikas pētījumos, nevar katra nozare darboties par sevi. Jāatbalsta, jāpapildina vienam otru. 

Saites

Collaborative workshop to explore regulatory use of non-animal approaches in chemical safety assessment

Informācija par Antivielu ab initio pētījumiem un nākotnes perespektīvām

EUROTOX (ES Toksikologu apvienība)

Highlights for alternatives ECOPA (E Consensus Platform for Alternatives)

CAAT (Center for Alternatives to Animal Testing)

New approach methods for a non-toxic environment  (Andrew Worth)

The assessment of uncertainty (Stephanie Bopp)

Read-Across Case Studies (Andrea Richarz)

The Long Range Science Strategy (LRSS) of Cosmetics Europe. Repeated dose systemic toxicity (Bas Blaauboer)

Defined Approaches for Skin Sensitisation (S. Casati)

The EU-ToxRisk project. A European flagship program for mechanismbased safety sciences and risk assessment

Validation as a part of the development process (Mounir Bouhifd)